Aunque fue un joven enclenque, acabó desarrollando una gran actividad deportiva hasta su graduación en 1847. Puesto que era buen delineante y su padre era amigo de famosos arquitectos, se matriculó en la Universidad de Gissen con la intención de estudiar Arquitectura. Después de acudir a unas conferencias de Justus von Liebig, decidió estudiar Química. Continuó sus estudios en Gissen, y disfrutó de becas post - doctorales en Paris (1851 - 1852, donde fue alumno de Jean Baptiste Dumas y de Charles Frédéric Gerhardt), en Chur (Suiza, 1852 - 1853, donde fue asistente junto con Adolph de Planta) y en Londres (1853 - 1855), donde fue influenciado de forma definitiva por Alexander Williamson. Obtuvo su doctorado en 1852, bajo la tutela de Justus von Liebig.

Kekulé fue el principal impulsor de la Teoría de la Estructura Química (1857 - 1858). Esta teoría procede de la idea de la valencia atómica, especialmente la tetravalencia del carbono (que Kekulé estableció más tarde en 1857) y de la capacidad de los átomos de carbono para enlazarse entre sí (establecida por Kekulé en mayo de 1858), para la determinación del orden de enlace de una molécula. Archibald Scott Couper, de manera independiente, llegó a la idea de la capacidad de auto - enlace de los átomos de carbono (su trabajo apareció en junio de 1858), y empleó las primeras fórmulas moleculares en las que las líneas simbolizaban los enlaces que conectan los átomos.

El trabajo más conocido de Kekulé se centró en la estructura del benceno. En 1865, Kekulé publicó un artículo en francés (aún se encontraba viviendo en la Bélgica francófona) en el que sugería que la estructura contiene un anillo de átomos de carbono de seis miembros con enlaces simples y dobles alternados. Al año siguiente, publicó un artículo mucho más extenso en alemán sobre el mismo tema. La fórmula empírica para el benceno se conocía desde hace tiempo, sin embargo, su estructura altamente insaturada estaba aún tratándose de determinar. Archibald Scott Couper en 1858, y Joseph Loschmidt en 1861, sugirieron posibles estructuras que contenían múltiples enlaces dobles o múltiples anillos, pero el estudio de compuestos aromáticos se encontraba en sus primerísimos años, y aún existían muy pocas evidencias que ayudaran a los químicos a decidirse por alguna estructura en particular. Kekulé se sirvió de evidencias que había acumulado en aquellos años para argumentar en favor de su estructura propuesta. Siempre parecía existir un solo isómero en los monoderivados del benceno y, exactamente, tres isómeros en los diderivados. El anillo simétrico de Kekulé parecía explicar estos curiosos hechos.

El nuevo entendimiento sobre el benceno y, por extensión, de todos los compuestos aromáticos, resultó ser tan importante tanto para la Química Pura como para la Química Aplicada, que en 1890 la Sociedad Química Alemana organizó una elaborada ceremonia en honor de Kekulé, celebrando el vigésimoquinto aniversario de su primer artículo sobre el benceno. En ella, Kekulé habló sobre la creación de su teoría. Dijo que había descubierto la forma del anillo de benceno después de tener una ensoñación sobre una serpiente que se mordía la cola (esto es un símbolo habitual en muchas culturas ancestrales, conocido como Ouroboros). Esta visión -comentó- le vino después de años de estudio sobre la naturaleza de los enlaces carbono- carbono.

En 1895, Kekulé fue ennoblecido por el Kaiser Guillermo II de Alemania, dándole el derecho a añadir "von Stradonitz" a su nombre, en referencia a una antigua posesión de su familia en Stradonice, Bohemia. De los cinco primeros premios Nobel en Química que se concedieron, tres fueron ganados por estudiantes suyos.